實時熒光定量PCR（Real-TimePCR，簡稱qPCR）是一種基于聚合酶鏈式反應（PCR）的高靈敏度、高特異性的分子生物學技術，用于定量分析DNA或RNA的含量。它通過實時監(jiān)測PCR反應過程中產(chǎn)生的熒光信號的變化來實現(xiàn)對靶標核酸的定量分析。
原理定義：
實時熒光定量PCR系統(tǒng)的原理基于PCR反應的擴增過程，在此過程中利用熒光染料或熒光探針對PCR產(chǎn)物進行實時檢測和定量。
PCR擴增過程：
通過PCR擴增反應，DNA模板經(jīng)過多個循環(huán)逐步擴增，生成大量的目標DNA片段。
在每一個循環(huán)中，模板DNA會被熱變性（使雙鏈DNA分開）、退火（引物與模板配對）和延伸（DNA聚合酶合成新鏈）等步驟逐漸擴增。
熒光信號的產(chǎn)生：
在擴增過程中，熒光染料或探針與PCR產(chǎn)物結合，產(chǎn)生熒光信號。實時PCR系統(tǒng)通過監(jiān)測這些熒光信號的變化來判斷目標核酸的數(shù)量。
常用的熒光探針和染料包括：
SYBRGreen：與雙鏈DNA結合時發(fā)出熒光，適用于檢測PCR產(chǎn)物。
TaqMan探針：是一種帶有熒光基團和猝滅基團的探針，只有當探針與目標DNA結合并在PCR反應過程中被DNA聚合酶切割時，才會釋放熒光信號。
MeltCurve分析：通過熔解曲線分析，可以進一步確認PCR產(chǎn)物的特異性。
實時檢測和定量：
在每一輪PCR擴增的過程中，實時熒光定量PCR系統(tǒng)都會在每一個擴增周期結束時，檢測熒光信號的強度。
熒光信號的強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此可以通過熒光信號的變化曲線來推算目標核酸的初始濃度。
在PCR反應的指數(shù)擴增階段，熒光信號與目標DNA的量呈指數(shù)關系，系統(tǒng)可以通過分析信號的上升曲線（Ct值，臨界閾值）來定量目標DNA或RNA的濃度。
定量分析：
Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）：是指PCR反應中，熒光信號達到預設的閾值時的循環(huán)數(shù)。Ct值與樣本中的初始靶標DNA/RNA濃度成反比，Ct值越小，表示初始模板的濃度越高。
標準曲線法：使用已知濃度的標準品構建標準曲線，根據(jù)樣本的Ct值對其進行定量。
相對定量：可以通過對照基因或內(nèi)參基因的表達量與目標基因的表達量進行比對，得出目標基因的相對表達量。
優(yōu)點：
高靈敏度與高特異性：通過實時監(jiān)測熒光信號，可以在PCR擴增的初期階段檢測到目標核酸，具有很高的靈敏度和特異性。
定量精準：實時監(jiān)測每一個PCR循環(huán)中的熒光信號，可以精確地定量目標核酸的初始含量。
無需后期電泳：與傳統(tǒng)的PCR方法不同，實時熒光定量PCR不需要使用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，減少了操作時間和誤差。
應用：
基因表達分析：用于檢測基因的相對或絕對表達量。
病原檢測：如病毒、細菌等的定量檢測。
基因突變分析：檢測特定基因的突變。
定量檢測DNA、RNA：適用于定量DNA或RNA模板，包括mRNA、miRNA、DNA甲基化等。
實時熒光定量PCR為分子生物學研究和臨床應用提供了強大的工具，尤其是在基因表達、疾病診斷和環(huán)境監(jiān)測等領域。
